• 09309181270

h IL-6

کیت سنجش سایتوکاین IL-6 انسانی شرکت بهپادطب ایرانیان

شرکت دانش بنیان بهپادطب‏ایرانیان با توجه به نیاز مبرم متخصصین داخل کشور با بهره‏گیری از توانمندی و تجربه متخصصین ایمونولوژی اقدام به تهیه کیت‏های سنجش سایتوکاین‏ها در مایعات بیولوژیک بدن نموده است. لازم به توضیح است که مواد اولیه این کیت‏ها از بهترین نوع مواد از شرکتR & D می‏باشد.

 

1- مقدمه

یکی از میانجی‏های التهابی مهم، اینترلوکین-4(IL-4) می باشد که سایتوکاینی مشتق شده از لنفوسیت‏های T کمک‏کننده و ماست‎سل‏ها است و باعث شروع سنتز IgE می‏شود. IL-4 نقش مهمی در پاسخ ایمنی آلرژیک با توجه به توانایی خود برای جلوگیری از آپوپتوز لنفوسیت‏های T دارد. به علاوه، اینترلوکین4 در تمایز سلول‏های لنفوسیت و تولید سایتوکاین‏ها و IgE نقش دارد.

2- اصول اندازه‏گیری

روش‌هاي ايمونولوژيك براي تعيين غلظت آنتي‌ژن داراي حساسيت و ويژگي عالي هستند و روشهاي استانداردي در تحقيقات يا كاربردهاي باليني مي‌باشند. اساس همه روش‌هاي ايمونوشيميايي جديد براي تعيين مقدار، اين است كه يك آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي خالص وجود دارد كه مقدار آن را مي‌توان با يك مولكول معرف اندازه‌گيري كرد. اگر مولكول معرف به صورت كووالان به يك آنزيم وصل شده باشد، مي‌توان با اسپكترومتر، ميزان تبديل سوبسترا بدون رنگ به محصولي رنگي توسط آنزيم را تعيين كرد و به اين وسيله مقدار آن مولكول را معين نمود به اين روش سنجش جذب ايمني آنزيمي (الايزا) یا به انگلیسی Enzyme – Linked Immunosorbent Assay (Elisa) گفته مي‌شود.

پایه اساسی آزمون الایزا براساس واكنش آنتی‌بادی با آنتی‌ژن می‌باشد. در آزمون‌های الایزا یك آنتی‌بادی اختصاصی با یك آنتی‌ژن مشخص واكنش داده و سپس با استفاده از یك آنتی‌بادی اتصال یافته با یك آنزیم بعنوان سیستم نشانگر، آزمون ادامه یافته و درنهایت با افزودن سوبسترای آنزیم و تبدیل سوبسترا به محصول كه یك ماده رنگی می‌باشد آزمون الایزا به پایان می‌رسد. طول موج رنگ بدست آمده كه نشانگر حضور یك آنتی‌بادی (و یا آنتی‌ژن) و نیز غلظت آن می‌باشد توسط یك دستگاه اسپكتروفتومتر قرائت شده و ثبت می‌گردد.

امروزه الایزا يكي از قدرتمند ترين روش هاي آزمايشگاهي براي پي بردن به مولکولهای سيستم ايمني است.

 

1- محتویات کیت

تاریخ انقضا

ظرف

شرایط نگهداری

مقدار/ تعداد   لازم برای 85 نمونه

مقدار/ تعداد لازم برای 40 نمونه

مقدار/ تعداد لازم برای 20 نمونه

محتویات کیت

مواد

6 ماه

ویال   0.2

C °70-

برحسب نوع

برحسب نوع

برحسب نوع

آنتی بادی اول

6 ماه

ویال   0.2

C °70-

برحسب نوع

برحسب نوع

برحسب نوع

آنتی بادی ثانویه

6 ماه

ویال   0.2

C °70-

برحسب نوع

برحسب نوع

برحسب نوع

استاندارد

6 ماه

ویال   0.2

C °4

30 میکرولیتر

15 میکرولیتر

10میکرولیتر

آنزیم HRP

حداکثر 6 ماه

ظرف تیره

10 میلی لیتری

C °4

10 میلی لیتر

5 میلی لیتر

2.5 میلی لیتر

TMB

(محلول رنگ زا)

ندارد

ظرف شیشه ای

10 میلی لیتری

C °4

10 میلی لیتر

5 میلی لیتر

2.5 میلی لیتر

Stop Solution

(محلول متوقف کننده)

ندارد

میکروتیوب

1.5 میلی لیتری

دمای اتاق

1000میکرولیتر

500 میکرولیتر

250 میکرولیتر

Tween 20

ندارد

زیپ کیپ کوچک

دمای اتاق

3 عدد

2 عدد

1 عدد

قرص PBS

ندارد

ظرف 2 میلی لیتری

C °4

2 گرم

1 گرم

0.5 گرم

BSA آلبومین

وسایل

ندارد

زیپ کیپ

دمای اتاق

یک عدد

یک عدد

یک عدد

میکرو پلیت 96 خانه مخصوص الیزا

ندارد

زیپ کیپ

دمای اتاق

یک عدد

یک عدد

یک عدد

چسب پلیت

ندارد

زیپ کیپ

دمای اتاق

100 عدد

50 عدد

50 عدد

سرسمپلر

 

 

 

2- وسایل مورد نیاز

1- دستگاه اسپکتروفوتومتر میکروپلیت مخصوص الیزا در طول موج 450 نانومتر

2- آب مقطر یا آب دیونیزه برای رقیق کردن محلولو شستشو

3- سمپلر تک کاناله و هشت کاناله قابل تنظیم در سایزهای مختلف

4- دستگاه shaker میکروپلیت الیزا

3- محلول سازی

1- تهیه محلول PBS: هر قرص PBS را در آب مقطر دو بار تقطیر یا آب دیونیزه حل کنید.

2- تهیه بافر شستشو: 0.05 درصد از Tween 20 در PBS (به هر 100 میلی لیتر PBS ، 50 میکرولیتر از Tween 20 اضافه می شود.)

3- محلول رقت سازی: یک درصد BSA در PBS (هر یک گرم از پودر BSA را در 100 میلی لیتر PBS حل کنید.) سپس آن را از فیلتر 0.2 میکرومتر بگذرانید.

4- رقیق سازی آنتی بادی اول:

آنتی بادی اول موجود در کیت با غلظت 720 میکروگرم/ میلی لیتر می باشد که باید برای استفاده به غلظت 4 میکروگرم/ میلی لیتر برسد.

5- رقیق سازی آنتی بادی دوم:

آنتی بادی دوم موجود در کیت با غلظت 2.25 میکروگرم/میلی لیتر می باشد که باید برای استفاده به غلظت 12.5 نانوگرم/میلی لیتر برسد.

6- رقت سازی استانداردها:

استاندارد موجود درکیت با غلظت 50 نانوگرم بر میلی لیتر می باشدکه باید برای بالاترین استاندارد به غلظت 2000 پیکوگرم در میلی لیتر برسد.

رقیق سازی آنتی بادی اولیه

تعداد نمونه

10 میکرولیتر از آنتی بادی اولیه + 1790 میکرولیتر   PBS

20 نمونه

15 میکرولیتر از آنتی بادی اولیه + 2685 میکرولیتر   PBS

40 نمونه

30 میکرولیتر از آنتی بادی اولیه + 5370 میکرولیتر   PBS

85 نمونه

 

8 میکرولیتر استاندارد موجود در کیت + 2072 میکرولیتر محلول رقت سازی

جهت تهیه سایر استانداردها با غلظت های 1000، 500، 250، 125 و 62.5 و 31.3 پیکوگرم از روش رقت سازی متوالی مطابق شکل زیر عمل می شود.

رقیق سازی آنتی بادی ثانویه

تعداد نمونه

10 میکرولیتر آنتی بادی اولیه + 1790 میکرولیتر   محلول رقت سازی

20 نمونه

15 میکرولیتر آنتی بادی اولیه + 2685 میکرولیتر   محلول رقت سازی

40 نمونه

30 میکرولیتر آنتی بادی اولیه + 5370 میکرولیتر   محلول رقت سازی

85 نمونه

 

 

 

 

 
   

 

 

7- رقیق سازی آنزیم HRP:

آنزیم موجود در کیت باید به نسبت 1 به 200 رقیق شود.

نکته: رقیق سازی آنتی بادی‏ها، استانداردها و آنزیم حتما 15 دقیقه قبل از استفاده انجام گیرد.

رقیق سازی آنزیم HRP

تعداد نمونه

10 میکرولیتر آنتی بادی اولیه + 1990 میکرولیتر محلول رقت سازی

20 نمونه

15 میکرولیتر آنتی بادی اولیه + 2985 میکرولیتر محلول رقت سازی

40 نمونه

30 میکرولیتر آنتی بادی اولیه + 5970   میکرولیتر محلول رقت سازی

85 نمونه

 

4- نحوه جمع آوری و آماده سازی نمونه ها

نمونه‏های مناسب سنجش توسط این کیت سرم- پلاسما- مایع رویی کشت سلول و یا سایر مایعات بدن می باشد. در صورتیکه سنجش سایتوکاینهای دیگری نیز مد نظر است در هنگام جمع آوری بهتر است نمونه ها در ویالهای کوچک جداگانه به تعداد سایتوکاینهای مورد نظر جمع آوری شود.

نمونه ها حداکثر تا یک ماه در فریزر منهای 20 قابل نگهداری می باشد( نمونه ها پس از جمع‏آوری باید ظرف چند ساعت و در شرایط سرد آماده انتقال به فریزر گردد و در صورتیکه محل نمونه گیری و فریز متفاوت است جابجایی نمونه ها در باکسهای حاوی یخ خشک صورت پذیرد) و در صورتیکه تا جمع آوری کامل نمونه‏ها بیش از یکماه زمان لازم است ، درمنهای 70 نگهداری شوند.

از فریز و دفریز کردن نمونه ها به شدت بپرهیزید. سایتوکاینها مولکولهای بسیار حساسی نسبت به PH ، حرارت و آنزیم های موجود در مایعات بیولوژیک هستند و نگهداری نمونه ها بیش از چند ساعت در شرایط نامناسب به ساختار و مقدار آنها آسیب می زند و سنجش دقیق آنها را تحت تاثیر قرار می دهد.

کلیه کیت ها از نظر کیفیت عملکرد کنترل شده و در صورتیکه نمونه های استاندارد جواب دهند، عدم جوابدهی نمونه ها مربوط به وضعیت نمونه و یا شرایط نگهداری و حمل آن است که شرکت مسئولیتی در قبال آن ندارد.

برای اندازه‏گیری دقیق نمونه‏هایی که مقدار آنها بیش از آخرین استاندارد باشد، ابتدا نمونه‏ها را با محلول رقیق‏سازی، رقیق کرده و سپس اندازه‏گیری مجدد به عمل آورید. بدیهی است در محاسبه‏ی نتایج این نمونه‏ها ضریب رقت منظور می شود.

5- روش کار

1- ابتدا 50 میکرولیتر از آنتی بادی اول رقیق شده را در چاهک‏های میکروپلیت 96 خانه ریخته و سپس با چسب مخصوص روی پلیت را می‏پوشانیم. پلیت را به مدت یک شب (Overnight) در دمای اتاق بر روی shaker با دور 300 میگذاریم.

2- چاهک‏ها را خالی کرده و سه بار با محلول شستشو می شوییم.

3- به هر چاهک میزان 300 میکرولیتر از محلول رقیق‏سازی اضافه می‏نماییم(مرحله Blocking ) و مجددا چست را بر روی پلیت می‏چسبانیم. سپس پلیت را به مدت یک ساعت روی shaker با دور 300 می گذاریم.

4-چاهک‏ها را خالی کرده و سه بار با محلول شستشو می شوییم.

5- به هر چاهک مقدار 50 میکرولیتر از استانداردها و نمونه ها اضافه می‏نماییم. جهت کنترل(blank) از محلول رقیق‏سازی در یکی از چاهک‏ها استفاده می‏نماییم و مجددا چست را بر روی پلیت می‏چسبانیم. پلیت را به مدت 2 ساعت روی shaker با دور 300 می گذاریم.

6- چاهک‏ها را خالی کرده و سه بار با محلول شستشو می شوییم.

7- 50 میکرولیتر از آنتی بادی دوم رقیق شده را به هر چاهک اضافه می نماییم و مجددا چست را بر روی پلیت می‏چسبانیم. پلیت را به مدت دو ساعت روی shaker با دور 300 می گذاریم.

8- چاهک‏ها را خالی کرده و سه بار با محلول شستشو می شوییم.

9- 50 میکرولیتر از آنزیم رقیق شده را به هر چاهک اضافه می نماییم و مجددا چست را بر روی پلیت می‏چسبانیم. پلیت را به مدت بیست دقیقه روی shaker با دور 300 می گذاریم.

10- چاهک‏ها را خالی کرده و سه بار با محلول شستشو می شوییم.

11- 50 میکرولیتر از محلول رنگ‏زا (TMB) را به هر چاهک اضافه می نماییم و در تاریکی به مدت پانزده دقیقه قرار می‏دهیم.

12- 25 میکرولیتر از محلول متوقف‏کننده به هر چاهک اضافه می‏کنیم.

13- میزان جذب نوری چاهک‏ها را در طول موج 450 نانومتر توسط دستگاه خواننده الیزا(Elisa Reader) می‏خوانیم.

6- محاسبه نتایج

پس از تعیین میزان جذب نوری استانداردها و نمونه‏ها و ترسیم منحنی استاندارد، غلظت نمونه‏ها قابل محاسبه است. متوسط مقادیر برای دو بار تکرار استانداردها، نمونه ها و کنترل را به دست بیارید. در منحنی مذکور که با استفاده از دستگاه الیزاریدر قابل برنامه ریزی و یا به صورت دستی قابل رسم است، محور Y شاخص میزان جذب نوری استانداردها در طول موج 450 نانومتر و محور X شاخص غلظت استانداردها برحسب IU/ میلی لیتر می‏باشد و سپس بهترین خطی که نقاط را روی نمودار به هم متصل کند رسم نمایید. ممکن است لازم باشد از داده‏ها لگاریتم بگیرید تا به صورت خطی تبدیل شوند.

اگر نمونه‏ها رقیق شده باشند، غلظت‏های خوانده شده از نمودار استاندارد باید در ضریب رقیق‎‏سازی ضرب شوند.

نکته: رسم منحنی استاندارد برای هر سری انجام آزمایش ضروری می‏باشد.

نمودار زیر نشان‏دهنده‏ی نمونه‏ای از داده‏های انجام شده برای سنجش کیت الیزای IL-4 انسانی می‏باشد

 

 

 

 

 

7- ویژگی حساسیت و اختصاصی بودن تست

به حداقل غلظت سایتوکاین که اختلاف جذب نوری آن نسبت به جذب نوری استاندارد صفر، معنی‏دار باشد، حساسیت کیت گفته می‏شود. این مقدار برای کیت الیزای IL-4 انسانی می‏باشد.

کیت الیزای IL-4 انسانی مختص همین سایتوکاین می‏باشد و هیچ واکنش غیراختصاصی با سایتوکاین های IL-4 موشی و... نمی‏دهد.

لیست کیت های سنجش سایتوکاینهای موجود در جدول ذیل قید شده است. سایر مواردی که در لیست قید نشده نیز درصورت تقاضا بررسی و سفارش پذیرفته می شود.

متقاضیان برای سفارش سنجش سایتوکاین می توانند همه روزه از شنبه تا چهارشنبه از ساعت 10 لغایت 17 با شماره تلفن 09309181270-88984953 مسئول ثبت درخواست ها و سفارشات شرکت تماس حاصل فرمایند.

به منظور رفاه حال محققین عزیز و تکریم مشتریان گرامی این شرکت، در انجام فرآیند سنجش کیت های داخلی با مصرف کنندگان کیت‏های بهپادطب ایرانیان با نازلترین قیمت همکاری می نماید.

ردیف

کیت­های موجود سنجش سایتوکاین

کیت انسانی

کیت موشی

کیت Rat

1

IFN-γ

ü

ü

 

2

TNF-α

ü

ü

ü

3

TGF-β1

ü

ü

 

4

MMP-3

ü

ü

 

5

MMP-9

ü

ü

 

6

VEGF

 

ü

 

7

IL-4

ü

ü

 

8

IL-10

ü

ü

 

9

IL-17

 

ü

 

10

IL-13

 

ü

 

11

IL-6

ü

ü

ü

12

IL-12 P70

ü

ü

 

13

HSP-70/HSP A1A

ü

 

 

14

GM-CSF

ü

 

 

15

CXCL10/IP-10

ü

 

 

16

CXCL8/IL-8

ü

 

 

17

CXCL12/SDF-1

ü

 

 

18

IL-1β/IL-1F2

ü

 

ü

 

 

 

پست الکترونیکی: این آدرس ایمیل توسط spambots حفاظت می شود. برای دیدن شما نیاز به جاوا اسکریپت دارید