الایزا ELISA

Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay

روش‌هاي ايمونولوژيك براي تعيين غلظت آنتي‌ژن داراي حساسيت و ويژگي عالي هستند و روشهاي استانداردي در تحقيقات يا كاربردهاي باليني مي‌باشند. اساس همه روش‌هاي ايمونوشيميايي جديد براي تعيين مقدار، اين است كه يك آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي خالص وجود دارد كه مقدار آن را مي‌توان با يك مولكول معرف اندازه‌گيري كرد. اگر مولكول معرف به صورت كووالان به يك آنزيم وصل شده باشد، مي‌توان با اسپكترومتر، ميزان تبديل سوبسترا بدون رنگ به محصولي رنگي توسط آنزيم را تعيين كرد و به اين وسيله مقدار آن مولكول را معين نمود به اين روش سنجش جذب ايمني آنزيمي (الايزا) گفته مي‌شود.

پایه اساسی آزمون الایزا براساس واكنش آنتی‌بادی با آنتی‌ژن می‌باشد. در آزمون‌های الایزا یك آنتی‌بادی اختصاصی با یك آنتی‌ژن مشخص واكنش داده و سپس با استفاده از یك آنتی‌بادی اتصال یافته با یك آنزیم بعنوان سیستم نشانگر، آزمون ادامه یافته و درنهایت با افزودن سوبسترای آنزیم و تبدیل سوبسترا به محصول كه یك ماده رنگی می‌باشد آزمون الایزا به پایان می‌رسد. طول موج رنگ بدست آمده كه نشانگر حضور یك آنتی‌بادی (و یا آنتی‌ژن) و نیز غلظت آن می‌باشد توسط یك دستگاه اسپكتروفتومتر قرائت شده و ثبت می‌گردد.

امروزه الایزا يكي از قدرتمند ترين روش هاي آزمايشگاهي براي پي بردن به مولکولهای سيستم ايمني است.

انواع مختلفي از الايزا وجود دارد: روش غير مستقيم ، روش الایزای ساندويچ و الایزای رقابتي يا مهاري

ولي رايج‌ترين نوع آن ، ساندويچ الايزا مي‌باشد.

شكل زیر انواع الایزا را نشان می دهد:

در روش غیر مستقیم ابتدا یک آنتی ژن بر روی سطح جامد پوشش داده می شود سپس نمونه مجهول که حضور و یا عدم حضور آنتی بادی برعلیه آنتی ژن پوشش داده شده در آن مورد بررسی قرار می گیرد افزوده می شود. پس از آن آنتی بادی ثانویه یا در حقیقت آنتی بادی بر علیه آنتی بادی اولیه اضافه می گردد

روش ساندويچ كه متداول ترين روش  الایزا  است، يك آنتي ژن در بين دو آنتي بادي اختصاصي قرار مي گيرد. مقدار ثابتي از يك آنتي‌بادي (آنتي‌بادي اول) به رديفي از سطوح جامد مثل حفرات ميكروپليت‌هاي پلاستيكي متصل مي‌شود.

روش هاي رقابتي نيز بر پايه رقابت دو آنتي ژن يا دو آنتي بادي براي اتصال ليگاند با مقدار محدود استوار است.

اگر اضافه كردن هردو آناليت به سيستم همزمان انجام شود، روش را رقابتي مي نامند ولي چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس  از يك دوره زماني انكوباسيون آناليت نشاندار اضافه گردد روش را مهاري مي نامند

الایزای ساندویچی

در سنجش اکثر فاکتورهای تحقيقاتی يا كاربردي باليني از روش الایزای ساندویچی استفاده می گردد لذا بشرح کاملتر این روش می پردازیم و پروتکل اجرایی نیز همین روش خواهد بود. برای این کار از پلیت های (Plate) 96 خانه ای استفاده می شود. بعضی از پلیت ها دارای خاصیت چسبندگی متوسط و بعضی دارای چسبندگی بالا (High binding) می باشند که جنس مورد اخیر از پلی استیرن است و توسط کمپانی سازنده مشخص می گردد. کف هر چاهک از این پلیت با آنتی بادی اول که معمولاً منوکلونال می باشند، پوشانده می شود. در واقع این آنتی بادی در بافر مناسبی با غلظت مشخص بصورت محلول در آمده و حجم معینی از آن در داخل چاهکها اضافه می گردد و با انکوباسیون پلیت در دما و مدت تعیین شده فرصت اتصال آنتی بادی مذکور به کف چاهکها داده می شود. این مرحله یکی از مهمترین مراحل الایزا می باشد که عمدتاً بر اساس واکنش های آبگریز (هیدروفوبی) ما بین ماتریکس پلاستیکی و پروتئین می باشد. عمل پوشش دهی (Coating) به عوامل زیر بستگی دارد:

1. مدت زمان پوشش دهی
2. دما
3. غلظت پروتئین هایی که باید پوشش داده شوند.
4. نسبت سطح چاهک ها به حجم محلول
5. ضریب انتشار مولکولهای پروتئینی درون محلول پوشش دهی

معمولاً بافر مناسب، غلظت آنتی بادی، دما ، مدت انکوباسیون و ... با بررسی و تکرارهای مختلف توسط طراحان الایزا و سازندگان کیت مشخص و در اختیار استفاده کنندگان قرار می گیرد.

البته اغلب در الایزاهای مختلف بیشترین بافرهایی که مورد استفاده قرار می گیرند عبارتند از:

بافر کربنات با کربنات 50 میلی مولار و PH = 9.6

Tris-HCL 20 میلی مولار و PH = 8.5

PBS    PH=7.2

در روشهای رایج امروزی پوشش دهی با PBS اغلب موفقیت آمیز است.

مدت انکوباسیون در پوشش دهی بیش از 12 ساعت بوده و معمولا بصورت یک شب (Overnight) می باشد.

دما معمولا دمای اتاق و گاهی فواصل میانی در یخچال (2-8^oC) پیشنهاد می گردد.

در پایان زمان پوشش دهی که جهت چسبیدن آنتی بادی اول اختصاص می باشد، لازم است چاهکها شستشو داده شود تا آنتی بادیهای اول نچسبیده خارج شوند. بافر مناسب شستشو توسط طراحان الایزا مشخص می شود اما اغلب PBS حاوی دترژانت غير يوني Tween 20 می باشد.

پس از اینکه کف چاهکها از آنتی بادی اول پوشش داده شد و قبل از انجام مراحل بعدی الایزا لازم است نقاط اتصال باقي مانده (نقاطي از كف چاهکها كه با پروتئين اختصاصي پوشانده نشده اند ) را با محلول پروتئيني مناسب و خنثي (از اين نظر كه در واكنش اختصاصي بعدي اثر سوئي ندارد) مسدود كرد (مرحله مسدود سازي blocking). محلول هاي پروتئيني براي اين منظور حاوي شير کم چربي يا آلبومين گاویBSA يا ژلاتين و يا کازئين ميباشند. علاوه بر پروتئين از دترژانت هاي غير يوني خاصي نظير Tween 20 يا Tween 80 يا ... نيز به عنوان كمكي استفاده مي شوند نوع اين مواد و مقادير بكار برده شده به صورت تجربي تعيين مي شوند. علاوه بر پروتئين و دترژانت، غلظت يوني بافر بلوك كننده نيز اهميت زيادي دارد و براي اتصال بهتر پروتئين مورد نظر، بافرهاي مختلف و غلظت يوني متفاوت ارزيابي و بهترين بافر را براي آزمايش پیشنهاد می دهند. مجدداً در پایان این مرحله لازم است جهت خروج پروتئین های نچسبیده شستشو چاهکها با بافر مناسب تعیین شده انجام گیرد.

تصویر مراحل یك الایزای ساندویجی

در مرحله ی بعد نمونه آزمون كه حاوي آنتي‌ژن با غلظت نامعلوم است و يك سري محلول‌هاي استاندارد كه غلظت آنتي‌‌ژن آنها معلوم است به حفرات جداگانه اضافه مي‌شوند تا به آنتي‌بادي متصل شوند. پس از انکوباسیون به مدت زمان کافی، در صورت حضور آنتی ژن در نمونه بر قسمت های Fab آنتی بادی می چسبد. آنتي‌ژنهاي متصل‌نشده پس از شستشو حذف مي‌شوند و آنتي‌بادي دوم که اغلب پلی کلونال می باشد، با آنزيم نشاندار شده به حفرات اضافه می شود. برای این آنتی بادی نیز حلال و غلظت مناسب با بررسیها و تکرارهای مختلف بدست آمده و مورد استفاده قرار می گیرد. معمولاً بافر حلال این آنتی بادی حاوی پروتئین خنثی و دترژانت هاي غير يوني به میزان خیلی کمتر از محلول شستشو می باشد. آنتی بادی دوم به اپي‌توپ‌هاي ديگري از آنتي‌ژن متصل مي‌شوند. آنتي‌ژن مثل يك پل عمل مي‌كند و لذا هرچه آنتي‌ژن بيشتري در محلول آزمون يا استاندارد وجود داشته باشند آنتي‌بادي دوم بيشتری متصل مي‌شود. پس از گذشت زمان انکوباسیون معین شده برای این مرحله و شستشو و حذف آنتی بادیهای دوم نچسبیده، آنزیم که معمولاً پراكسيداز HRPاست در بافر مناسب و غلظت تعین شده اضافه می گردد و زمانی برای اتصال آن به آنتی بادی دوم داده می شود. جهت تقویت قدرت اتصال آنزیم به آنتی بادی دوم از قدرت تقويت كنندگي بيوتين-آويدين، بيوتين-استرپتاويدين و یا لكتين-ليگاند و ... استفاده مي شود. البته در برخی از کیتها آنتی بادی دوم از قبل با آنزيم نشاندار شده (Conjugation) می باشد که در این حالت بدلیل اینکه آنزیم از قبل به آنتی بادی دوم چسبیده است زمان انکوباسیون برای آنتی بادی دوم و آنزیم یکی می شود. پس از شستشوی نهایی که مهمترین شستشوی یک الایزا می باشد چرا که در صورت باقی ماندن کمترین مقدار آنزیم نچسبیده می تواند موجب ایجاد رنگ اضافی در مرحله بعدی گردد، سوبسترا (Substrate) که برای آنزم پراکسیداز TMB(Tetramethylbenzidine) می باشد اضافه می گردد. حاصل اثر آنزیم بر روی محلول سوبسترا یک محصول رنگی (در مورد TMB آبی رنگ می شود) می باشد. البته برای اینکه سوبسترا بر اثر آنزیم محصول رنگی تولید نماید باید با یک رنگزا (کروموژن) همراه باشد که معمولا در طراحی کیتها انجام شده و یا نوع کروموژن جهت اضافه کردن مشخص می گردد. مدت زمانی که به آنزیم فرصت داده می شود تا سوبسترا را به محصول رنگی تبدیل کند باید مشخص و محدود باشد چون اين واكنش در طي زمان منجر به جمع شدن مقدار متنابهي از محصول در محيط مي شود بدين معني كه با گذشت زمان معيني يك مولكول آنزيم مي تواند مولكول هاي سوبستراي بسياري را به محصول تبديل كند و لذا درصورت محدود نبودن زمان مولکولهای آنزیم کمی که در غلظتهای پایین وجود دارند می توانند میزان رنگ تولید شده در چاهک مربوط به غلظتهای کم را به میزان رنگ چاهکهای با غلظت بالا برسانند. جهت محدود کردن زمان اثر آنزیم بر سوبسترا از محلول متوقف کننده که می تواند اسید سولفوریک 2N باشد استفاده گردد. معمولاً با استفاده از این محلول متوقف کننده تغییر رنگی در محصول رنگی ایجاد می نماید که البته در میزان شدت رنگ چاهکها اثری ندارد (آبی حاصل از اثر آنزیم پراکسیداز بر TMB به زرد تبدیل می شود.)

میزان تشکیل رنگ، نشانگر میزان آنتی ژن در نمونه آزمون می باشد. در نهايت رنگ توليد شده توسط دستگاه قرائت كننده (Eliza reader) خوانده می شود. از جذب نوری محلول رنگی ایجاد شده در چاهک های مربوط به محلول‌هاي استاندارد استفاده مي‌شود تا منحني میزان جذب نوری به غلظت آنتي‌ژن در استانداردها رسم شود و نهایتاً با رسم نمودار می توان با بردن جذب نوری محلول رنگی ایجاد شده در چاهک های مربوط نمونه ها مقدار آنتي‌ژن به صورت دقیق در آنها بدست آید محاسبه گردد. امروزه نرم افزارهای مربوط به دستگاههای الایزا ریدر بصورت خودکار میزان غلظتها را از روی جذب نوری های بدست آمده محاسبه و در اختیار کاربر قرار می دهند.

تصویر کمپلکس نهایی ایجاد شده در چاهک

انتخاب پروتکل عملی(انتخاب کیت):

از آنجائیکه امروزه برای اکثر فاکتورهایی که در تحقيقات يا كاربردهاي باليني مورد سنجش قرار می گیرند طراحی کیت الایزا صورت گرفته و برای بسیاری از این فاکتورها بدلیل تولید انبوه کیت، استفاده از آنها بصرفه تر می باشد بدون شک دستورالعمل موجود در هر کیت باید مبنای انجام الایزا با آن کیت قرار گیرد. لذا ترکیب محلولها ، غلظتهای آنها و مقادیر مورد استفاده بسته به دستورالعمل کیتها متفاوت خواهد بود.

اکثر کیتهای تولیدی (بخصوص در کیتهای سنجش فاکتورهای روتین در آزمایشگاههای تشخیص طبی) دارای پلیت آماده پوشش داده شده با آنتی بادی اول می باشند (در واقع یک مرحله از الایزا که حساسیت بالاتر و زمان بیشتری صرف می کند در این کیتها از قبل انجام گردیده است) و سایر مواد برای مراحل بعدی با غلظتهایی که باید مورد استفاده قرار گیرند در آنها بصورت آماده (محلول در حلالهای مربوطه با غلظت مناسب) قرار دارند. اما امروزه برخی کمپانی های معتبر دنیا در مورد فاکتورهای اختصاصی تر تحقیقاتی اقدام به تولید کیتهایی تحت عنوان Development System Eliza Kit نموده اند که فاقد پلیت داخل بسته کیت بوده و در واقع فقط حاوی اجزاء اصلی الایزا (آنتی بادی اولیه ، آنتی بادی ثانویه، استاندارد و آنزیم) بصورت لیوفلیزه و یا با یک غلظت چند برابر می باشد و برای انجام الایزا بر روی تعداد زیادی نمونه (بالای 5 پلیت) می تواند مورد استفاده قرار گیرد.